52024年來，人們一直對《蒙娜麗莎》神秘的微笑莫衷一是。不同的觀者或在不同的時間去看，感受似乎都不同。有時覺得她笑得舒暢溫柔，有時又顯得嚴肅，有時像是略含哀傷，有時甚至顯出譏嘲和揶揄。在一幅畫中，光線的變化不能像在雕塑中產生那樣大的差別。但在蒙娜麗莎的臉上，微暗的陰影時隱時現，為她的雙眼與唇部披上了一層面紗。而人的笑容主要表現在眼角和嘴角上，達·文西卻偏把這些部位畫得若隱若現，沒有明確的界線，因此才會有這令人捉摸不定的“神秘的微笑”。
哈佛大學神經科專家利文斯通博士說，蒙娜麗莎的微笑時隱時現，是與人體視覺系統有關，而不是因為畫中人表情神秘莫測。利文斯通博士是視覺神經活動方面的權威，主要研究眼睛與大腦對不同對比和光暗的反應。利文斯通說：“笑容忽隱忽現，是由於觀看者改變了眼睛位置。”她表示，人類的眼睛內有兩個不同部分接收影像。中央部分(即視網膜上的淺窩)負責分辨顏色、細緻印記。環繞淺窩的外圍部分則留意黑白﹑動作和陰影。據利文斯通說，當人們看著一張臉時，眼睛多數集中注視對方的雙眼。假如人們的中央視覺放在蒙娜麗莎的雙眼，較不準確的外圍視覺便會落在她的嘴巴上。由於外圍視覺並不注重細微之處，無形中突出了顴骨部位的陰影。如此一來，笑容的弧度便顯得更加大了。不過，當眼睛直視蒙娜麗莎的嘴巴，中央視覺便不會看到陰影。利文斯通說：“如果看著她的嘴巴，便永遠無法捕捉她的笑容。”蒙娜麗莎的笑容若隱若現，源於人們的目光不斷轉移。利文斯通指出，若要臨摹《蒙娜麗莎》，描繪口部時便要望著別處。
1993年，加拿大美術史家蘇珊·吉魯公布了一項令人震驚的研究成果。她說蒙娜麗莎那傾倒無數觀賞者的口唇，是一個男子裸露的脊背。這一論斷既新鮮又荒誕，然而論證是有力的。集畫家、雕刻家、建築師、工程師及科學家等多種才藝於一身的達·文西，可謂是個“怪傑”。他喜歡穿粉紅色外套，在鬍鬚上毫無顧忌地塗上五顏六色，還常稱自己解剖過不下30具死屍。他還是個左撇子，習慣從右到左倒著書寫，別人要藉助鏡子才能讀出他寫的東西。因此藉助鏡子亦不失為欣賞者讀畫的一種方法。鏇轉90度後從鏡中看蒙娜麗莎抿著的笑唇，恰好是一個背部線條分明的結實男性脊背以及左臂和肘部的一角;再說，表現人體美和呼喚人性的覺醒，既是大師的人生哲學，又是他的藝術觀。