某些物質受紫外光或可見光照射激發後能發射出比激發光波長較長的螢光。物質的激發光譜和螢光發射光譜，可以用作該物質的定性分析。當激發光強度、波長、所用溶劑及溫度等條件固定時，物質在一定濃度範圍內，其發射光強度與溶液中該物質的濃度成正比關係，可以用作定量分析。螢光分析法的靈敏度一般較紫外分光光度法或比色法為高，濃度太大的溶液會有“自熄滅”作用，以及由於在液面附近溶液會吸收激發光，使發射光強度下降，導致發射光強度與濃度不成正比，故螢光分析法應在低濃度溶液中進行。
所用的儀器為螢光計或螢光分光光度計，按各藥品項下的規定，選定激發光波長和發射光波長，並配製對照品溶液和供試品溶液。
由於不易測定絕對螢光強度，故螢光分析法都是在一定條件下，用對照品溶液測得濃度的線性範圍後，再在每次測定前，用一定濃度的對照品溶液校定儀器的靈敏度；然後在相同的條件下，讀取對照品溶液及其試劑空白與供試品溶液及其試劑空白的讀數，用下式計算供試品濃度：
r<[i]>-r<[ib]>
c<[i]>＝──────×c<[r]>
r<[r]>－r<[rb]>
式中
c<[i]>為供試品溶液的濃度；
c<[r]>為對照品溶液的濃度；
r<[i]>為供試品溶液的讀數；
r<[ib]>為供試品溶液試劑空白的讀數；
r<[r]>為對照品溶液的讀數；
r<[rb]>為對照品溶液試劑空白的讀數。
因螢光分析法中的濃度與讀數的線性較窄，故(r<[i]>－r<[ib]>)/(r<[r]>－r<[rb]>)應為0.50～2.0；如有超過，應在調節溶液濃度後再測。
對易被光分解的品種 ,可選擇一種激發光和發射光波長與之近似而對光穩定的物質溶液，例如藍色螢光可用硫酸奎寧的稀硫酸溶液，黃綠色螢光可用螢光素鈉水溶液，紅色螢光可用羅丹明b水溶液等,先與對照品溶液比較測定其讀數關係，並在測定供試品溶液時用以代替對照品溶液，以校定儀器的靈敏度。
螢光分析法因靈敏度高，故干擾因素也多。溶劑不純會帶入較大誤差，應先作空白檢查，必要時，套用玻璃磨口蒸餾器蒸餾後再用。溶液中的懸浮物對光有散射作用，必要時，套用垂熔玻璃濾器濾過或用離心法除去。所用的玻璃儀器與測定池等也必須保持高度潔淨。溫度對螢光強度有較大的影響，測定時應控制溫度一致。溶液中的溶氧有降低螢光作用，必要時可在測定前通入惰性氣體除氧。