這是一個在路上的真實故事，一段年輕的格瓦拉成長的旅程。
1952年1月4日，23歲的格瓦拉和朋友艾伯特騎著機車從阿根廷出發，歷時8個月，穿越南美洲，行程2萬多公里。那時他還不是後來被同志們親熱呼喚的“切”，而是一個家境優裕、正主攻麻風學的醫學院學生“恩尼斯托”，臨行時還沒有結束三門課的畢業考試。青年格瓦拉，是一名狂熱的橄欖球愛好者，也是個不時發作的哮喘病患者。夥伴艾伯特，29歲的生物化學家，一個風趣好玩的傢伙，有點世故有點油滑，自命“遊蕩的化學家”，這個角色使影片充滿了活潑和戲劇性。兩個朋友的坐騎是一輛諾頓（norton）500型的機車，被格瓦拉家人戲謔地稱為“女人車”，他卻叫它“強壯者”。這兩個精神夢想家跌跌撞撞地駛出了布宜諾斯艾利斯，面對廣袤的美洲大陸，他們滿懷激情地要去探索世界、追尋夢想。正如片頭艾伯特邊收拾行囊邊哼唱的：去靈魂帶我們去的地方！
《摩托日記》並非以革命為主題，而是一部有關成長的公路電影。不少主人公在原野上馳往往天際的鏡頭異常壯麗，以格瓦拉的日記旁白為線索，而視角卻是客觀、紀錄性的，真實地還原了格瓦拉作為一名熱愛土地和生活的青年之本色面貌，淳樸、真誠，不諳世事又對複雜的世界充滿了好奇、勇敢與熱情。這又是他不同於處事圓滑的同伴艾伯特，亦不同於大多數常人的不凡之處。一路上他和同伴穿越了廣闊瑰麗的美洲大陸，也經歷了不斷認識自我、認識世界，摸索探尋理想的曲折歷程。
與格瓦拉的未婚妻道別後，旅途伊始充滿了浪漫色彩。天際的雪山融入雲端，茫茫大草原，牛羊成群，寧謐如詩。阿根廷的安第斯山脈，雨季的亞馬遜河大詩人帕斯在著名長詩《太陽石》中所熱烈歌詠的秘魯高峰……鄉間音樂會的喧鬧歡快，把酒豪飲的農莊男人，熱烈多情的拉丁女人……天地間人世斑斕的風景，他們一一盡收眼底。格瓦拉欣悅於自己與土地更接近了。
風餐露宿是沿途經常有的事。“強壯者”一再拋錨，終於報廢后只好當作一堆廢鐵折賣了。不得已他們徒步、搭車、乘船，沒錢了沿途行醫，借宿於窮苦的底層人民。一開始，他們並不爽快地擠住在工人的棚窩裡，因為他們是醫生，是從上流社會的宅邸和舞會上離開的有身份的人。可越多接觸到各行各業普通的人們，兩位年輕人的胸懷越開闊，逐漸關心起社會的現實。在智利的馬奇古礦山過夜，他們與一對礦工夫婦徹夜長談，格瓦拉深深同情礦工被壓迫的命運，而因為他們是共產黨員，因此所受的迫害愈甚。得知他們的兒子也旅行去了，接著那位母親說出了令他動容的話：你們旅行是為了旅行，而我們兒子是為了尋找工作。格瓦拉的日記里說，這是我一生最冷的晚上。他一路珍藏著未婚妻臨行時給他的15塊美金，哪怕是哮喘病發作時也捨不得花了醫治，而這次他悄悄地送給了這對礦工夫婦。
他們目睹了眾多無名的苦難與不公。養病牛的牧人，瘸腿的洗車工，和他無錢醫治、孤寂赴死的老母親；原住民印加人懂得醫學、天文學和數學，卻為操武器的西班牙殖民者奴役。
“這條河病了。”格瓦拉凝視著窗外。在秘魯的聖帕堡，他們擺渡前往河流對岸被隔離的麻風病人區，拒戴手套並毫不避嫌地主動握住病人的手。在小木屋裡，格瓦拉耐心勸說一名絕望的女子動手術。談到他自己的哮喘，他說：我會說的第一個詞是“注射劑”……手術後，他又徹夜陪坐在她床前安慰。他們和麻風病人一起蓋房子，擊鼓，踢足球，像兄弟般鼓舞著病人們重生的信念。
在為他們送行的晚會上，人們也為格瓦拉慶祝生日。“我們拉丁美洲人應該團結起來。”他的慷慨陳詞預示著他日漸孕育的夢想：為美洲大陸的人們解放自由而鬥爭。
旅途結束時格瓦拉在日記里寫道：這不是一個英雄的故事，這是兩個生命相遇走在一起，有共同夢想的經歷。我們的見識狹隘嗎？也許。可這次旅行後，美洲大陸改變了。我不再是我，從前的我。
之後他是切？格瓦拉，一個在顛簸的路上走向非凡人生的赤子。這個人用雙腳丈量了土地，並立志要改變整個大陸的命運。如此廣博胸懷的人物，在途中他已把自己拋給了民眾，拋給了大地。
影片的結尾在字幕中，又穿插重現著主人公在旅途中拍攝的黑白舊照，鏡頭前的普通人：工人、農民、孩童、牧人、賣水果的女人……如第三隻永不厭倦的眼睛，注視著塵封的歷史中無數鮮活的生命，藝術使他們不再被湮沒。青春和理想，也在這部《摩托日記》的顛簸中永遠定格。