電泳法,是指帶電荷的供試品(蛋白質、核苷酸等)在惰性支持介質(如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠等)中,於電場的作用下,向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動,使組分分離成狹窄的區帶,用適宜的檢測方法記錄其電泳區帶圖譜或計算其百分含量的方法。
各電泳法,除另有規定外,照下述方法操作。
一、紙電泳法
1.儀器裝置
包括電泳室及直流電源兩部分。
常用的水平式電泳室裝置如圖,包括兩個電泳槽a和一個可以密封的玻璃(或相應材料)蓋b;兩側的電泳槽均用有機玻璃(或相應材料)板c分成兩部分;外格裝有鉑電極(直徑0.5~0.8cm)d;里格為可放濾紙e的有機玻璃電泳槽架f,此架可從槽中取出;兩側電泳槽a內的鉑電極d經隔離導線穿過槽壁與外接電泳儀電源相連。
電源為具有穩壓器的直流電源,常壓電泳一般在100~500v,高壓電泳一般在500~10 000v。
2. 操作法
(1) 電泳緩衝液
枸櫞酸鹽緩衝液(ph3.0)
取枸櫞酸 (c6h8o7·h2o)39.04g與枸櫞酸鈉(c6h5na3o7·2h2o)4.12g,加水4000ml,使溶解。
(2) 濾紙
取色譜濾紙置1mol/l甲酸溶液中浸泡過夜,次日取出,用水漂洗至洗液的ph值不低於4,置60℃烘箱烘乾,備用。可按需要裁成長27cm、寬 18cm的濾紙,或根據電泳室的大小裁剪,並在距長度方向一端5~8cm處劃一起始線,每隔2.5~3cm處做一記號備點樣用。
(3) 點樣有濕點法和乾點法。濕點法是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩衝液(ph3.0)中,濕潤後,取出,用濾紙吸乾多餘的緩衝液,置電泳槽架上,使起始線靠近陰極端,將濾紙兩端浸入緩衝液中,然後用微量注射器精密點加供試品溶液,每點10μl,共3點,並留2個空白位置。
乾點法是將供試品溶液點於濾紙上,吹乾、再點,反覆數次,直至點完規定量的供試品溶液,然後用噴霧器將濾紙噴濕,點樣處最後噴濕,本法適用於稀的供試品溶液。
(4) 電泳
於電泳槽中加入適量電泳緩衝液,浸沒鉑電極,接通電泳儀穩壓電源擋,調整電壓梯度為18~20v/cm,電泳約1小時45分鐘,取出,立即吹乾,置紫外光燈(254nm)下檢視,用鉛筆劃出紫色斑點的位置。
(5) 含量測定
剪下供試品斑點和與斑點位置面積相近的空白濾紙,剪成細條,分別置試管中,各精密加入0.01mol/l鹽酸溶液5ml,搖勻,放置1小時,用3號垂熔玻璃漏斗濾過,也可用自然沉降或離心法傾取上清液,按各藥品項下的規定測定吸收度,並按吸收係數計算含量。
二、醋酸纖維素薄膜電泳法
1.儀器裝置
電泳室及直流電源同紙電泳。
2.試劑
(1) 巴比妥緩衝液(ph8.6)取巴比妥2.76g,巴比妥鈉15.45g,加水溶解使成1000ml。
(2) 氨基黑染色液
取0.5g的氨基黑10b,溶於甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。
(3) 漂洗液
取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml,混勻。
(4) 透明液
取冰醋酸25ml,加無水乙醇75ml,混勻。
3.操作法
(1) 醋酸纖維素薄膜
取醋酸纖維素薄膜,裁成2cm×8cm的膜條,將無光澤面向下,浸入巴比妥緩衝液(ph8.6)中,待完全浸透,取出夾於濾紙中,輕輕吸去多餘的緩衝液後,將膜條無光澤面向上,置電泳槽架上,經濾紙橋浸入巴比妥緩衝液(ph8.6)中。
(2) 點樣與電泳
於膜條上距負極端2cm處,條狀滴加蛋白含量約5%的供試品溶液2~3μl,在10~12v/cm電位梯度下電泳。電泳區帶距離以4~5cm為宜。
(3) 染色
電泳完畢,將膜條取下浸於氨基黑染色液中,2~3分鐘後,用漂洗液浸洗數次,直至脫去底色為止。
(4) 透明
將洗淨並完全乾後的膜條浸於透明液中10~15分鐘,取出平鋪於潔淨的玻板上,乾後即成透明薄膜,可於分光光度計上測定和作標本長期保存。
(5) 含量測定
未經透明處理的醋酸纖維素薄膜電泳圖可按各藥品項下規定的方法測定,一般採用洗脫法或掃描法,測定各蛋白質組分的相對百分含量。
洗脫法
將洗淨的膜條用濾紙吸乾,剪下供試品溶液各電泳圖譜的電泳區帶,分別浸於1.6%的氫氧化鈉溶液中,振搖數次,至洗脫完全, 於一定波長下測定吸收度。同時剪取與供試品膜條相應的無蛋白部位,同法操作作對照。先計算吸收值總和,再計算各蛋白組分所占百分率。