研究課題名稱
硫化氫在大鼠燒傷休克後應激反應中的作用
一、研 究 內 容 和 意 義
探討大鼠重度燒傷休克後氣體信號分子硫化氫(h2s)血清中的變化對燒傷休克後早期應激反應的影響，主要表現為血管活性物質(組胺、p物質)和大鼠心率、血壓的變化，為重度燒傷早期的休克應激反應引入新的理論機制，為燒傷後抗休克治療尋找新的研究方向。78隻雄性sd大鼠，隨機分為非燒傷組和燒傷組。燒傷組又分為單純燒傷組、nahs組、ppg組。燒傷組大鼠製成30%三度燙傷後，在6h、12h、24h、48h、96h各時項點採集血清。採用敏感硫電極法測定血清h2s濃度，採用試劑盒分析儀分析血清中血管活性物質(組胺、p物質)變化，採用16道生理指標測量儀測定大鼠心率、血壓。單純燒傷組血清硫化氫濃度較非燒傷組明顯升高。單純燒傷組、nahs組、ppg組兩兩比較均有差異。燒傷後大鼠不同時期血清硫化氫濃度不同。不同硫化氫濃度下血管活性物質表達不同。硫化氫可能參與並抑制燒傷休克後應激過程，為重度燒傷後抗休克治療提出新的研究方向。
二 、選題依據
闡述該選題的研究意義，分析和該研究課題有關的國內外研究概況和發展趨勢。
近年來研究發現，生理濃度的硫化氫(hydrogensulfide，h2s)具有多種的生理功能，與氣體分子 no、co在部分生物學功能方面相同或相似，因此它被看作體[1]內第三種的氣體信號分子 ，在多個系統中具有重要的病理生理學意義，已成為國內外醫學研究的熱點。研究已發現它在高血壓、缺氧性肺動脈高壓等疾病的發病過程中具有重要的作用。然而對疾病情況下的 h2s作用的認識則剛剛起步。本實驗通過外源性h2s干預燒傷後大鼠，觀測大鼠重度燒傷休克後早期應激反應中兩種血管活性物質(組胺、p物質)和大鼠心率、血壓的變化，從而進一步了解硫化氫在重度燒傷休克後早期應激過程中的作用。
2、國內外主要參考文獻(列出作者、論文名稱、期刊名稱、出版年月)
[1] rawlinson a.nitric oxide，inflammation and acute burn injury[j].burns.XX.29：631—640.
[2] 盛志勇，郭振榮.危重燒傷治療與康復學[m].北京：科學出版社。XX：180—183.
[3]marius g.deane，annie sablotzki，andreas hoffmann et a1.a1- iterations of acute phase reaction and cytokine production in pa— tents following severe burn injury[j].burns，XX 28(6)：535— 542.
[4] 陳曉東，王順賓，江瓊，等.內毒素對嚴重燒傷後細胞因子、可溶性粘附分子及 sfas/sfasl的影響[j].中華急診醫學雜誌，XX，13(7)：470-473.
[5]阮晶華，王燕.宋克征等血清中clip濃度測定的臨床價值[j].中國醫學檢驗雜誌，XX，5(1)：62—64.
[6]於方治.c一反應蛋白與心血管疾病[j].上海醫學檢驗雜誌，1999， 14(5)：264—265.405.
[7] 蘇贊彩，王優，唐蘭芬.環孢素對哮喘大鼠c一反應蛋白、轉化生長因子一b 、基質金屬蛋白酶類及其抑制劑表達的影響[j]. 實用兒科臨床雜誌，XX，21(16)：1078—1079.
[8] 單 英，鄭成中，秦 炯，等.缺氧缺血性腦病新生兒血清超敏 c反應蛋白與血小板參數的變化及其臨床意義 [j].實用兒科臨床雜誌，XX，21(12)：751-752.
[9] 付紅敏，王劍鋒，李平，等.非感染性疾病致全身炎症反應綜合徵患兒血 c反應蛋白、vw 因子的變化[j].實用兒科臨床雜誌 ，XX，21(12)：743，776.
[10]jaye dl，waites kb.clinical applications of c—reactive protein in
pediatrics[j].pediatr infect dis j，1997，16(8)：735-746.
[11]范友芬，許小敏.嚴重燒傷患者早期血清 c反應蛋 白的變化 [j].浙江實用醫學，XX，11(1)：25.
[12]胡榮，劉友生.全身性炎症反應綜合徵的研究進展[j].中華燒傷雜誌， XX.16：313—315.
[13]袁建成，肖光夏.腫瘤壞死因子 mrna在嚴重燙傷大鼠小腸中的表達及細胞定位的研究 .中華整形燒傷外科雜誌，1996，12：163
[14]kerr me，bender cm，monti ki.an introduction to ox. ygen free radicals.heart lung，1996;25：200
[15]楊紅明，盛志勇，等 .嚴重燙傷大鼠延遲復甦後多器官損傷機制中的氧 自由基作用 .中華整形燒傷外科雜誌， 1995，1 1：106
[16]王平,張建新,李蘭芳,等.硫化氫對大鼠內毒素性急性肺損傷的影響[j]. 中國藥理學通報，XX,24(9)：1232—1236.
[17] 呂海建，盂宏，方向京，等.重組人生長激素治療嚴重燒傷患者的研究[j].中國基層醫藥，XX，13(1)：54-55.
[18]sies h，sharov vs，klotz lo，et al：glutathione peroxi. dase protects against peroxynitrite——mediated oxidations——a new function for selenoproteins as peroxynitrite reduetase.j biol chem 1997：272：27812
[19]cetinkale 0，senei o.bulun rthe efect of antioxi· dant therapy oncell—mediated：immunity following bum injury in an animal mod el bums，1999，25：113
三 、研究內容、創新之處
1、選題的目的、研究內容：
硫化氫作為第三種氣體信號分子套用於各領域的多方面研究，並得出可觀的研究成果。氣體信號分子具有多種病理生理作用。近年來，不少研究人員紛紛開始了氣體信號分子在燒傷中，尤其重度燒傷後全身應激反應中作用的研究。並取得具有一定價值的研究結果。目前，氣體信號分子尤其是硫化氫在燒傷方面的研究尚且不足，有待做出更多的相關研究。以更多了解硫化氫等在燒傷休克應激反應中的套用價值。
本實驗套用大面積燒傷大鼠模型 ，通過對外源性硫化氫干預重度燒傷大鼠對血清中血管活性物質(組胺、p物質)表達的影響和大鼠心率血壓的改變，探討其與燒傷休克後應激反應的關係，為臨床嚴重燒傷後抗休克治療尋求可能有效的治療藥物提供實驗依據，也為對硫化氫的進一步研究提供實驗數據。
2、意義及創新之處：
⑴首次研究h2s是否參與了燒傷休克早期應激的病理生理過程。
⑵研究燒傷休克後血清中血管活性物質(組胺、p物質)表達的變化規律。
⑶為嚴重燒傷早期應激過程引入新的理論機制，為燒傷抗休克治療尋找新的研究方向。
3、套用前景：
第三種內源性氣體信號分子h2s 越來越受到人們的廣泛關注和重視,成為當前生物醫學領域研究的熱門課題。h2s 具有多種生物學效應, 在全身多系統中參與了許多方面的生理及病理生理過程，揭示了某些疾病未知的發病機理，並提出了新的治療途徑，具有廣闊的研究前景和套用價值。目前對h2s在心血管循環系統、神經系統及消化系統等的研究已有很大的成果，但在大面積嚴重燒傷病人臟器保護及與全身炎症反應綜合徵方面的研究相對缺乏。 本實驗旨在探討h2s對嚴重燒傷後早期應激反應的抗休克作用，從而為臨床重度燒傷患者的疾病演變和治療提供一條新的思路。
四 、課題設計方案
包括研究工作的主要技術路線、實驗方法或資料收集方法、統計處理的方法等：
1.主要技術路線
2.試驗方法
1)動物模型製備及分組
78隻健康雄性 sd大鼠，體重 200～240 g，購於青海省地方病疾病控制中心。在大鼠適應性餵養1周后，隨機分為非燒傷組和燒傷組。燒傷組又分為單純燒傷組、nahs干預組、ppg干預組。分別設6h、12h、24h、48h組各6隻，燒傷組大鼠背部脫毛並烏拉坦麻醉後，仰臥固定在燒傷模型板上，將背部裸露皮膚浸泡在95°c恆溫水箱中20秒，製成30%三度燙傷後，立即用紗布拭乾水漬，腹腔注射生理鹽水40 ml/kg抗休克，自由進食水。nahs干預組補液復甦後腹腔注射硫氫化氫2ml，ppg干預組復甦後腹腔注射ppg2ml。正常對照組大鼠予以背部剃毛及麻醉後浸入 37 cc水浴中假燙 20 s，假燙後不給復甦補液 。單純燒傷組背部剃毛及麻醉後浸入95 cc水浴中燙 20 s，燙後復甦補液，不給任何干預。
2)大鼠血壓、心率的測定。
各組大鼠均在6 h、12 h、24 h、48 h、96 h各時相點內分別隨機選取對應大鼠，烏拉坦(100 mg/kg)麻醉下 ，用16道生理測量儀，在頸部頸動脈插管下測定大鼠心率、血壓。
3)血標本的採集和處理。
各組大鼠均於取血前 12 h禁食，於6 h、12 h、24 h、48 h、96 h各時相點內分別隨機選取對應大鼠，烏拉坦(100 mg/kg)麻醉下 ，剖腹 ，直視下腹主動脈採血 ，每隻大 鼠抽血 2 ml，室溫 下靜置約 20 min後 ，XX轉離心 10 分鐘，分離出血清 ，置於 一70℃冰櫃中冰凍保存，待測。
4)血清硫化氫及各血管活性物質的含量測定
血清中血管活性物質(組胺、p物質)的含量測定採用酶聯免疫吸附(elisa)法 ，硫化氫採用比色法測定，操作均按照說明書進行。分別記錄每時相點檢測血清中各個因子含量 ，比較 各組大 鼠血 清 中硫化氫及c-反應蛋白、il-6、總體抗氧化能力的含量變化。
3.統計學處理方法
採用 spss17.0統計軟體進行統計分析。計數資料用例數及百分數表示，計量資料以均數 ±標準差( ±s)表示。率的比較採用卡方檢驗;不同時相點下各組間均數比較採用方差分析，兩組間均數的比較採用 lsd檢驗;同一時相點兩組間比較採用 t 檢驗 。以 p<0.05表示差異具有統計學意義標準。
五、實施計畫進度
XX.9---XX.10 文獻資料的檢索、課題預調查、撰寫綜述。
XX.10---XX.11 藥物置備、動物購買、預實驗及撰寫開題報告。
XX.11---XX.1 動物實驗研究。
XX. 1--XX.2 實驗指標檢測及數據整理統計、撰寫論文。
XX. 2—-XX. 4 完成論文，審查論文。
六、預期研究成果
預期結果及其意義：
通過對大鼠燒傷後給予外源性氣體信號分子硫化氫(h2s)前後血清血管活性物質(組胺、p物質)和大鼠心率、血壓動態變化的對比，表明h2s參與了燒傷休克早期應激的病理生理過程，並有一定的抗休克作用。為嚴重燒傷早期休克的病理生理變化引入新的理論機制，為燒傷抗炎治療尋找新的研究方向。
七、估算課題工作量、完成課題的條件
1、儀器設備、人員配備、實驗動物、藥物試劑等：
(1)儀器設備:
95℃恆溫水浴箱;
高轉速離心機;
16道生理指標測量儀;
敏感硫電極;
722光柵分光光度計;
酶標儀。
(2)人員配置：
符合條件的實驗室及相關技術人員的指導和協助。
(3)實驗動物
健康雄性sd大鼠78隻，體重200～250 g，青海省地方病疾病控制中心選購。
(4)藥物試劑
硫氫化鈉(nahs)注射液;ld-炔丙基甘氨酸(ppg)注射液;烏拉坦麻醉劑;大鼠組胺(his)酶聯免疫分析試劑盒;大鼠p物質(sp)酶聯免疫分析試劑盒;抗壞血酸(c6h8o6);氫氧化鈉(naoh);乙二胺四乙酸二鈉(edta);na2s•9h2o;l-半胱氨酸;5’-磷酸吡哆醛;磷酸二氫鉀;磷酸氫二鉀;三氯乙酸;三氯化鐵;醋酸鋅;對氨基二甲基對苯二胺鹽酸鹽
2、開展科學研究的經費
項 目經費支出(元)備 注(依據與說明)
一、研究經費
1、科研業務費
(1)測試/計算/分析費
(2)能源/動力費1000
(3)會議/差旅費
(4)出版物/文獻信息費500
2、實驗材料費
(1)原材料/試劑/分析費2650兩個個試劑盒2200元;麻醉劑450元
(2)其他4160實驗大鼠、籠具及飼料
3、儀器設備
(1)購置
(2)試劑
4、實驗室改裝費
二、勞務費
三、合計8310
說明
八、存在的問題及解決的辦法措施
1、 預計研究過程中可能遇到的困難和問題：
1)研究經費不足;
2)試劑質量問題;
2)缺少相應的實驗設備;
3)專業實驗經驗不足;
4)動物飼養過程及實驗過程中可能出現的誤差;
5)不可預知的問題。
2、解決的辦法和措施：
1)儘量節省開支及嚮導師申請資金。
2)嚴格按照動物飼養要求，每組多預備一隻。
3)嚴格按照文獻記載造模並進行預實驗;力爭掌握成熟的實驗操作方法，並可尋求有經驗的實驗技術人員的指導。
4)完善實驗前期的準備工作，參閱相關文獻資料，找到相關的理論依據。
5)操作過程力求規範，檢測設立標準質控，儘量選同一批號的試劑，藥物。
6)向公衛系及高原實驗中心尋借儀器。