（1）脂肪酸的活化脂肪酸的氧化首先須被活化，在atp、co-sh、mg2+存在下，由位於內質網及線粒體外膜的脂醯coa合成酶，催化生成脂醯coa.活化的脂肪酸不僅為一高能化合物，而且水溶性增強，因此提高了代謝活性。
（2） 脂醯coa的轉移脂肪酸活化：是在胞液中進行的，而催化脂肪酸氧化的酶系又存在於線粒體基質內，故活化的脂醯coa 必須先進入線粒體才能氧化，但已知長鏈脂醯輔酶a是不能直接透過線粒體內膜的，因此活化的脂醯coa要藉助肉鹼（camitine），即l-3羥-4-三甲基銨丁酸，而被轉運入線粒體內，線上粒體內膜的外側及內側分別有肉鹼脂醯轉移酶i和酶ⅱ，兩者為同工酶。位於內膜外側的酶ⅰ，促進脂醯coa轉化為脂醯肉鹼，後者可藉助線粒體內膜上的轉位酶（或載體），轉運到內膜內側，然後，在酶ⅱ催化下脂醯肉鹼釋放肉鹼，後又轉變為脂醯coa.這樣原本位於胞液的脂醯coa穿過線粒體內膜進入基質而被氧化分解。一般10個碳原子以下的活化脂肪酸不需經此途徑轉運，而直接通過線粒體內膜進行氧化。
（3）脂醯coa的β氧化：脂醯coa進入線粒體基質後，在脂肪酸β氧化酶系催化下，進行脫氫、加水，再脫氫及硫解4步連續反應，最後使脂醯基斷裂生成一分子乙醯coa和一分子比原來少了兩個碳原子的脂醯coa. 因反應均在脂醯coa烴鏈的α，β碳原子間進行，最後β碳被氧化成醯基，故稱為β氧化。
a 脫氫：脂醯coa在脂醯基coa脫氫酶的催化下，其烴鏈的α、β位碳上各脫去一個氫原子，生成α、β烯脂醯coa（trans-y-enoyl coa），脫下的兩個氫原子由該酶的輔酶fad接受生成fad.2h.後者經電子傳遞鏈傳遞給氧而生成水，同時伴有兩分子atp的生成。
b 加水：α、β烯脂醯coa在烯醯coa水合酶的催化下，加水生成β-羥脂醯coa（βhydroxy acylcoa）。
c 再脫氫：β-羥脂醯coa在β-羥脂醯coa脫氫酶（l-βhydroxy acyl coadehydrogenase）催化下，脫去β碳上的2個氫原子生成β-酮脂醯coa，脫下的氫由該酶的輔酶nad+接受，生成nadh＋h+ .後者經電子傳遞鏈氧化生成水及3分子atp. d 硫解：β-酮脂醯coa在β-酮脂醯coa在硫解酶（β-ketoacylcoa thiolase）催化下，加一分子coa sh使碳鏈斷裂，產生乙醯coa和一個比原來少兩個碳原子的脂醯coa.以上4步反應均可逆行，但全過程趨向分解，尚無明確的調控位點。
1分子軟脂酸含16個碳原子，靠7次β氧化生成7分子nadh+h+，7分子fadh2，8分子乙醯coa，而所有脂肪酸活化均需耗去2分子atp.故1分子軟脂酸徹底氧化共生成：7×2+7×3+8×12-2＝129分子atp