由於電泳法具有靈敏度高、重現性好、檢測範圍廣、操作簡便併兼備分離、鑑定、分析等優點,故已成為生物技術及生化藥物分析的重要手段之一。現就該方法基本原理,分類和套用概要介紹如下。
(一)電泳法的基本原理和分類 在電解質溶液中,帶電粒子或離子在電場作用下,以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現象叫電泳。
電泳分離是基於溶質在電場中的遷移速度不同而進行的。一個離子在電場中的移動速度為(公式) (式中解釋)
根據電泳的分離特點及工作方式,電泳可分為三大類:
(l)自由界面電泳:在二根u形管里的溶液中,同種分子的構型及荷電情況基本一致,在電場影響下,它們逐漸密集而與其他電泳遷移率不同的物質之間形成明顯的界面。
(2)區帶電泳:在電泳過程中,套用各種不同的惰性支持介質,在電場作用下,使具有不同泳動速度的組分形成各自區帶的電泳。根據所用的支持物不同可分為:紙電泳法、醋酸纖維素薄膜電泳法、聚丙烯醯胺凝膠電泳法和十二烷基硫酸納(sds)聚丙烯醯胺凝膠電泳法。
(3)高效毛細管電泳:是在一根內徑約50μm的毛細管中,在高壓電場下進行樣品分離分析的一種新型電泳技術。
(二)常用電泳法的類型及其套用
1.紙電泳法紙電泳法是用濾紙作為支持介質的一種電泳法,其操作要點如下:
(1)緩衝液的選擇:應根據供試品的理化特性,需要的電泳速度和分辨力,選擇適宜的緩衝液、ph值和離子強度。
(2)濾紙的裁剪:濾紙可按需要裁成與電泳槽相當的長方形或長條形,樣點的間距為2~3cm,濾紙長度視電源輸出最高電壓及所需的電場強度而定,電壓恆定時,所需場強越大,濾紙裁得越短。
(3)點樣方法:分乾點法與濕點法。乾點法是將供試品溶液點於濾紙上,吹乾,再點,反覆數次直至點完規定量的供試品溶液,然後用噴霧器將濾紙噴濕,點樣處最後噴濕。乾點法能濃縮供試品,適用於稀的供試品溶液。濕點法是將濾紙全部浸入緩衝液中,濕潤後,取出,用濾紙吸乾多餘的緩衝液,濾紙點樣部分需用架子架起,點的次數不宜過多,稀的供試品溶液應預先濃縮。濕點法優點是可保持供試品的天然狀態,點樣後立即接通電源以免擴散。
(4)電泳及區帶顯示:將點好的濾紙放電泳槽上。控制電壓、電流和電泳時間。電泳後,濾紙從槽中取出,晾乾或烘乾。不同的供試品採用不同的顯色方法,如核苷酸類藥物可直接在紫外光燈下觀察定位,而有些物質必須用顯色劑顯色。
(5)定量測定:紙電泳的定量方法與紙色譜的定量方法一樣,可以用洗脫法或光密度計掃描法進行。但目前光密度計掃描法已被醋酸纖維素薄膜電泳法取代。這是因為在紙電泳法中,支持物濾紙對蛋白質樣品的吸附力較大,且濾紙本身為極性物,透明化步驟較煩,不利於光密度計掃描法定量測定。
紙電泳法可用於蛋白質、核苷酸等生化藥物的測定。如核苷酸,具有共軛雙鍵的嘌呤或嘧啶鹼基,在一定的ph條件下,具強紫外吸收,電泳後濾紙在紫外光燈下顯示紫色,用鉛筆定位,剪下相應的部位,進行洗脫,在特定波長下測定供試品的吸收度,按其吸收係數可計算出某一核苷酸的含量。三磷酸腺苷二鈉(atp)的含量測定即屬於此類。
atp在生產中易帶入adp等雜質,儲存中也易分解成adp,因而採用紙電泳分離atp後的分光光度法進行測定。測定方法如下:
取本品,精密稱定,加水製成每1ml中約含10mg的溶液,照中國藥典附錄紙電泳法測定。電泳畢,取出吹乾,置紫外光燈(254nm)下檢視,用鉛筆劃出跑在濾紙最前面的紫色斑點,剪下供試品斑點和與斑點面積相近的空白濾紙並剪成細條,分別放入試管中,精密加入0.01mol/l鹽酸液5ml,攪勻,放置 1r,待紙纖維全部下沉,傾取上清液,照分光光度法,在257士1nm波長處測定吸收度,減去濾紙空白吸收度的平均值,按c的吸收係數(e)為263計算含量。
2.醋酸纖維素薄膜電泳法 本法是用醋酸纖維素薄膜為支持物的一種電泳方法。醋酸纖維素薄膜是纖維素的羥基乙醯化形成的纖維素醋酸酯,將其溶於有機溶劑後,塗抹而成的均勻薄膜。醋酸纖維素薄膜電泳己套用於血清蛋白、脂蛋白等的分離和定量測定。
3.聚丙烯醯胺電泳法聚丙烯醯胺電泳法(簡稱page)是以人工合成的聚丙烯醯胺作為惰性支持介質的電泳方法。其分離效果主要取決於分子所帶電荷與分子大小的比例,也取決於與分子量大小有關的分子篩效應。page依電泳槽和凝膠層中的緩衝液體系ph和凝膠孔徑大小是否一致而加以區別,相同的為連續體系,不相同的為不連續體系。圓盤電泳屬於後者。
page與其他電泳法比較具有如下優點:①電泳區帶狹窄不易擴散,供試品用量極微,電泳分離時間短,設備簡單,解析度高,重複性佳,已廣泛用於酶、蛋白、聚核苷酸、多肽的分析鑑定和少量製備。②凝膠是以單體-烯醯胺和交聯劑.甲撐雙丙烯醯胺聚合而成的縱鏈交錯的且有“分子篩效應的三維網狀結構”。其機械性能優良,對熱穩定,無色透明,無雜質,不溶於緩衝液,在280nm波長處無紫外吸收。電泳時無電滲和吸附作用,適於供試品的定量和精製。
4. sds聚丙烯醯胺凝膠電泳法(簡稱sdelpage) sdspage是測定蛋白和酶等大分子物質分子量的有效方法。其原理是根據大多數蛋白都能與陽離子表面活性劑十二烷基硫酸納(sds)按重量比結合成複合物,使蛋白分子所帶的負電荷遠遠超過天然蛋白分子的負電荷,消除了不同蛋白分子的電荷效應,使蛋白分子相對遷移率(ri)的大小完全取決於分子量的高低,可從已知分子量的標準蛋白的對數和相對遷移率所作的標準曲線中求出供試品的分子量。
sdspage的優點是設備簡單、操作方便、試劑易得、誤差較小、重複性好。該法可用常規染色法,亦可用紫外吸收掃描法進行分子量測定、電泳純度檢查和電泳成分百分含量測定。
5.瓊脂糖凝膠電泳法 瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂糖為基質的一種電泳方法。現簡述如下:
(1)制膠:取瓊脂糖約0.2g,加水10ml置水洛加熱使溶脹完全,然後加入溫熱的醋酸-鹽鹽緩衝液(ph3.0),混勻,趁熱將膠液塗布於大小適宜(7.5cm×2.5cm或9cm×4m)的玻璃板上,厚度約3mm,靜置,待凝膠結成無氣泡的均勻薄層,即得。
(2)標準晶溶液及供試品溶液的製備:照各藥品項下規定配製。
(3)點樣與電泳:在電泳槽內加入醋酸.鋰鹽緩衝液(ph3.0),將凝膠板置於電泳槽架上,經濾紙橋浸入緩衝液。於凝膠板極端分別點樣1μl,立即接通電源,在電壓梯度約30v/cm,電流強度1~2ma/cm的條件下,電泳約20min,關閉電源。
(4)染色與脫色:取下凝膠板,用甲苯胺藍溶液(0.1%,w/v)染色,用水洗去多餘的染色液至背景無色為止。
(5)定量:選擇適宜的檢測方法如分光光度法等,以標準晶對照法進行樣品的含量測定。
(6)套用:由於瓊脂糖凝膠具有較大孔徑,因此,瓊脂糖凝膠電泳法特別適用於rna、dna等核糖核酸類及其衍生物類藥物的分離。