但是，由於國共兩黨代表不同的階級利益，實行不同的抗戰指導路線，統一戰線內部存在著尖銳的矛盾和鬥爭。黨中央記取歷史的經驗教訓，堅持獨立自主原則，即既統一又獨立，對國民黨採取有團結有鬥爭，以鬥爭求團結的方針。
1937年11月底，中共駐共產國際代表、共產國際執委王明從蘇聯回國抵達延安，否認統一戰線中的獨立自主原則。1938年3月，中共中央派任弼時到蘇聯，向共產國際說明中國的抗戰情況。8月，中共駐共產國際代表王稼祥回國，傳達共產國際的指示：中共中央的政治路線是正確的，中央要以毛澤東為首來解決統一領導。
1938年9月至11月，黨在延安召開擴大的六屆六中全會。全會總結抗戰以來的經驗教訓，確定黨在抗日戰爭戰略相持階段的基本方針和任務，重申必須獨立自主地領導人民進行抗戰。會議進一步確立了毛澤東在全黨的領導地位。
三、堅持抗戰、團結、進步，系統闡述新民主主義理論
1938年10月武漢和廣州失守後，抗戰進入戰略相持階段。日本侵略軍調整策略，停止對正面戰場的戰略性進攻，將主要力量用於打擊八路軍和新四軍；對國民黨則採取政治誘降為主、軍事打擊為輔的方針。
1938年12月，以國民黨副總裁汪精衛為首的國民黨親日派公開投敵，並拼湊偽中央政權。
以蔣為代表的國民黨親英美派開始推行消極抗日、積極反共政策。1939年1月，國民黨五屆五中全會決定“溶共”、“防共”和“限共”的方針。各地接連發生襲擊、殺害共產黨領導的抗日軍民的反共磨擦事件。
針對國內時局的逆轉趨勢，黨鮮明地提出堅持抗戰到底反對中途妥協、鞏固國內團結反對內部分裂、力求全國進步反對向後倒退三大口號，堅決揭露打擊賣國漢奸汪精衛，繼續爭取同蔣介石集團合作，鞏固並擴大抗日民族統一戰線。
自敵後抗日根據地成為日軍軍事進攻主要對象，黨領導人民抗日力量肩負起抗擊日軍的主要責任。八路軍於1938年冬開始由山區向平原地區挺進，鞏固和擴大了晉察冀、晉冀豫、冀魯豫、晉西北、山東等抗日根據地。
1940年8月，為了粉碎敵人對抗日根據地的“掃蕩”和“囚籠”政策，八路軍總部對華北日軍發動了一次大規模的以破襲敵人交通線為重要目標的進攻戰役—百團大戰。戰役沉重地打擊敵軍，激發了全國人民的抗戰熱情。
與此同時，新四軍貫徹黨中央“發展華中”的戰略方針，建立了皖東、豫皖蘇、皖東北、豫鄂、蘇北等抗日根據地，堅持和擴大蘇南、皖中等根據地。到1940年底，黨領導的軍隊由抗戰開始時的5萬餘人發展到50萬人，抗日根據地發展到跨華北、華中、華南的廣大地區，加上陝甘寧邊區共17塊近1億人口。
黨在國民黨統治區的工作也取得新的進展。1939年1月，中共中央南方局在重慶成立。在周恩來、董必武等人領導下，重視爭取和團結中間勢力，同民主黨派、無黨派人士、國民黨民主派、地方實力派、著名知識分子等廣泛接觸，共商國是。1941年3月，中國民主政團同盟(1944年改組為中國民主同盟，簡稱民盟)在重慶成立。
1939年冬至1940年春，國民黨頑固派掀起第一次反共高潮，黨給予堅決回擊。
1941年初，國民黨頑固派製造了皖南事變，掀起第二次反共高潮。面對掀起又一次反共高潮，黨採取軍事上嚴守自衛、政治上堅決反擊的方針。毛澤東揭露國民黨頑固派破壞抗戰的陰謀，提出懲辦禍首、釋放葉挺、廢除國民黨一黨專政、實行民主政治等十二條解決辦法。周恩來在重慶向國民黨當局提出嚴重抗議，並親筆題詞“為江南死國難者誌哀”。
黨鬥爭中豐富和發展了統一戰線的策略，採取了“發展進步勢力，爭取中間勢力，孤立頑固勢力”的總方針，堅持了“人不犯我，我不犯人，人若犯我，我必犯人”的自衛立場和“有理、有利、有節”的原則。
期間，國民黨頑固派還大肆鼓吹“共產主義不適合中國國情”等反共謬論。黨在政治思想戰線上批判和揭露各種假三民主義，闡述三民主義與共產主義的關係。毛澤東於1939年底1940年初先後發表《<共產黨人>發刊詞》、《中國革命和中國共產黨》、《新民主主義論》等著作，完整地闡述了新民主主義理論，指出，半殖民地半封建社會的性質，決定了中國革命必須分成兩步走，第一步進行民主主義革命，第二步進行社會主義革命。中國民主革命在五四運動以後已經不是資產階級領導的民主革命，而是新民主主義的革命。新民主主義革命是無產階級領導的人民大眾的反帝反封建的革命。區別新舊民主主義革命性質的根本標誌是無產階級領導權問題。